Para qué son usadas las enzimas de restricción en el método Sanger

Visualizar patrones de corte en el gel

Cuantificar la cantidad de ADN en una muestra

¿Con cuál método (shotgun o por amplicones) se puede inferir las funciones de los genes?

Shotgun -> Anotación funcional

Amplicones -> Anotación estructural

Shotgun -> Anotación taxonómica

Amplicones -> Anotación funcional

La metataxonómica logrará identificar a nivel de cepa, ¿verdadero o falso?

Falso, solo a nivel de género o especie

Verdadero, el 16s sirve exactamente para estudios de identificación a nivel de cepa.

Falso, en metataxonómica solo se podrá identificar a nivel de familia y no más.

Depende de la técnica utilizada

¿Qué tipos de análisis se pueden realizar mediante metagenómica si se decida ensamblar el genoma?

Perfil taxonómico y anotación funcional de genes con COG

Perfil taxonómico y anotación estructural de genes

Recuperación de genomas de MAGs

Análisis de expresión génica y perfiles de metilación

¿Cuál es el kit con el que se puede hacer análisis shotgun aún con poca cantidad de ADN?

Ligation kit -> Whole genome amplification, porque amplifica todos los genes, no solo un target gene como el análisis amplicon-based

QIAGEN kit -> Fragmentación del ADN, porque es más económico

PCR kit -> Amplificación de genes específicos, porque es más preciso

Sequencing kit -> Secuenciación por Sanger, porque ofrece una alta calidad

Análisis de gene prediction

(Después del ensamblaje) (gene and function profiling), búsqueda de ORFs, es decir búsqueda de proteínas codificantes

(Antes del mapeo) (gene and function annotation), predicción de genes codificantes

(Después del mapping) (gene expression analysis), análisis de expresión génica

(Después del ensamblaje) (gene structure prediction), predicción de la estructura de genes

Para realizar análisis taxonómico después del secuenciamiento por el enfoque shotgun, ¿se necesita ensamblar el genoma?

No necesariamente, ya que solo se necesitarán los reads.

Sí, ya que es esencial para la identificación taxonómica.

Depende del software utilizado.

Sí, pero solo en casos de alta complejidad.

Beneficios del método tradicional de identificación de bacterias

Sencillo de aplicar, se puede distinguir organismos basándose en su morfología

Económico, ya que no requiere costosos equipos y reactivos solo placas agar.

Muy rápido, ya que puede producir resultados en cuestión de minutos sin necesidad de incubación.

Robusto, ya que es capaz de identificar incluso a nivel de cepa.

¿Qué tipo de BLAST usarías para catalogar genes?

BLASTx, ya que se compararán las regiones de los genes codificantes de proteínas con proteínas en la base de datos

BLASTp, ya que se compararán las secuencias de proteinas con secuencias de proteínas

BLASTn, ya que se compararán las secuencias de nucleótidos con secuencias de nucleótidos en la base de datos

TBLASTn, ya que se compararán secuencias de genes con secuencias de genes en la base de datos

¿En qué se basa Gene Catalogue?

Comparación de genes obtenidos y verificados por BLASTn de una base de datos curada, y AGRUPAMIENTO para evaluarlos con un programa de anotación funcional

Secuenciación de genomas completos para identificar nuevos genes y secuencias genéticas únicas.

Predicción de genes mediante programas de modelado de estructuras de proteínas.

Estudio de genes de función desconocida en el genoma de organismos extremófilos.

Diferencias entre riqueza y abundancia

Abundancia es la cantidad, la riqueza es el número de especies diferentes presentes en una muestra.

Abundancia es la cantidad de biomasa presente, la riqueza es la diversidad de especies.

Abundancia es la diversidad de especies, la riqueza es el número de copias genéticas por organismo.

Abundancia es la diversidad genética, la riqueza es la diversidad de funciones metabólicas.

¿Qué son los COG's y para qué sirven en metagenómica?

Es un método de análisis para anotación funcional basado en relaciones evolutivas o ortología en filogenia. -> Predicción de su función por agrupación de genes

Es una técnica para ensamblar secuencias cortas en una única secuencia más larga. -> Predicción de secuencias únicas en el metagenoma.

Es un conjunto de genes presentes en la comunidad microbiana. -> Identificación de la diversidad taxonómica.

Son genes altamente conservados en todas las bacterias. -> Identificación de genes esenciales.

¿Qué porcentaje del genoma ha sido secuenciado (ej: 98%) Cobertura = (N x L)/G N = Número de lecturas L = Tamaño de una lectura G = Tamaño del genoma.

¿Cuántos genes funcionales se han identificado en el metagenoma? -> Determina la diversidad funcional.

¿Cuántas secuencias únicas de genes se han encontrado en el metagenoma? -> Evalúa la diversidad genética.

¿Cuántos fragmentos de ADN se han secuenciado en total? -> Representa la profundidad del secuenciamiento.

¿Cuántas veces una zona del genoma ha sido secuenciada (ej. 93x). Número de lecturas que cubren una región

¿Cuántas lecturas de calidad se han obtenido en el secuenciamiento? -> Representa la calidad del metagenoma.

¿Cuántos genes conocidos se han identificado en el metagenoma? -> Evalúa la diversidad taxonómica.

¿Cuántas copias de genes específicos se han encontrado en la comunidad? -> Evalúa la abundancia de funciones metabólicas.

Anotación estructural

Identifica regiones codificantes, no codificantes, intrones, exones, variantes, mutaciones, etc. Es decir, el “tipo” de zona que es.

Descubre qué regiones hacen qué (COG con Prokka) A nivel de anotación de genes, no de secuencias.

Busca similitudes entre secuencias del metagenoma y bases de datos curadas. -> Predicción de la diversidad taxonómica.

Realiza un análisis estadístico de las secuencias para determinar su significado biológico.

Descubrir qué regiones hacen qué (COG con Prokka) A nivel de anotación de genes, no de secuencias.

Identifica regiones codificantes, no codificantes, intrones, exones, variantes, mutaciones, etc. Es decir, el “tipo” de zona que es.

Asigna funciones a secuencias desconocidas utilizando redes neuronales artificiales.

Clasifica las secuencias de acuerdo con su función metabólica, como oxidación-reducción o transporte.

Después del secuenciamiento del 16S amplificado en metataxonómica, ¿qué pasos en bioinformática prosiguen?

Procesamiento de datos, control de calidad y análisis

Ensamblaje de novo, asignación taxonómica y anotación funcional

Secuenciación por Sanger, análisis de expresión génica y construcción de árboles filogenéticos.

Desalineación de secuencias, ensamblaje de metagenoma y modelado de estructuras de proteínas.

¿Qué dos enfoques existen en el análisis del secuenciamiento por 16S?

Basado en referencias o basado en diversidad

Basado en metagenómica o basado en metataxonómica

Basado en genómica comparativa o basado en transcriptómica

Basado en filogenia o basado en ecología

Metataxonómica basada en referencia

Compara las secuencias con una base de datos de 16S conocidas para identificar microorganismos específicos.

Analiza la diversidad de la comunidad microbiana, útil para estudios de diversidad y comunidades no documentadas en bases de datos.

Utiliza secuenciación de metagenoma y ensamblaje de novo para identificar genes taxonómicamente relevantes.

Realiza secuenciación Sanger y compara las secuencias de 16S con secuencias de referencia en bases de datos.

Metataxonómica basada en diversidad

No identifica especies, analiza la diversidad de la comunidad microbiana, útil para estudios de diversidad y comunidades no documentadas en bases de datos.

Compara las secuencias con una base de datos de 16S conocidas para identificar microorganismos específicos.

Utiliza secuenciación de metagenoma y ensamblaje de novo para identificar genes taxonómicamente relevantes.

Realiza secuenciación Sanger y compara las secuencias de 16S con secuencias de referencia en bases de datos.

Diferencias entre Fastq y fasta

Fasta -> > y Fastaq -> @ + Valores de calidad (archivo de 4 líneas)

Fastq -> > y Fasta -> @ + Valores de calidad (archivo de 4 líneas)

Fasta -> @ y Fastaq -> > + Valores de calidad (archivo de 4 líneas)

Fastq -> @ y Fasta -> > + Valores de calidad (archivo de 4 líneas)

Determinar la abundancia exacta de organismos

Ningún método es adecuado para determinar la abundancia exacta en metataxonómica y metagenómica

Se utiliza un análisis cuantitativo basado en lecturas únicas en secuenciación por amplicones

Se utiliza una técnica de qPCR específica para cada organismo.

La abundancia exacta se determina mediante la secuenciación de todo el genoma de un organismo.

Utilidad de secuenciación por amplicones

Se utiliza para comprender la composición de comunidades microbianas, rastrear cambios en la estructura de la comunidad y generar hipótesis.

Se utiliza para obtener genomas completos de microorganismos y estudiar su funcionalidad metabólica.

Se utiliza para obtener secuencias de genes únicos y determinar la abundancia exacta de especies en una muestra.

Se utiliza para identificar patógenos específicos en muestras clínicas.

El output de un análisis mediante OTU´s o ASV podrán ser

análisis de diversidad alfa donde se analizará solo un habitat a nivel de la riqueza o diversidad, es decir el número de especies presente.

beta diversidad para analizar la diferencia de especies en varios habitats

¿Qué método de análisis utiliza OTUs y ASV?

Análisis metataxonómico (a nivel de secuencia)

Análisis de expresión génica

Análisis filogenético de genes

Análisis de la estructura tridimensional de proteínas

Utilidad de metagenómica

Proporciona información sobre el potencial funcional y es más útil para evaluar la abundancia relativa de genes y la diversidad. Permite el acceso a poblaciones microbianas previamente no cultivables.

Se utiliza para obtener secuencias de genes únicos y determinar la abundancia exacta de especies en una muestra.

Se utiliza para identificar patógenos específicos en muestras clínicas.

Se utiliza para obtener genomas completos de microorganismos y estudiar su funcionalidad metabólica.

¿Qué es un OTU en el contexto de la secuenciación de amplicones?

Un OTU (Operational Taxonomic Unit) es un grupo de secuencias de ADN que se consideran similares en función de un umbral de similitud predefinido.

Un OTU (Operational Taxonomic Unit) es una secuencia única de ADN que se utiliza para identificar una especie en particular.

Un OTU (Operational Taxonomic Unit) es un grupo de especies que comparten el mismo genoma.

Un OTU (Operational Taxonomic Unit) es una secuencia única de ADN que se utiliza para estudiar la diversidad genética en una comunidad microbiana.

¿Cuál es la función de la PCR en el análisis de metagenómica?

La PCR se utiliza para amplificar genes específicos o regiones del ADN antes de la secuenciación.

La PCR se utiliza para secuenciar directamente el ADN de una muestra sin amplificación previa.

La PCR se utiliza para cortar las secuencias de ADN en fragmentos más cortos para facilitar la secuenciación.

La PCR se utiliza para etiquetar las secuencias de ADN con fluorocromos antes de la secuenciación.

Ventajas de la secuenciación Illumina en metagenómica

Alta calidad de datos, alta velocidad de secuenciación y bajos costos por base.

Largo alcance de lectura, capacidad de ensamblaje de novo y menos generación de artefactos

Análisis en tiempo real y generación de lecturas largas.

Posibilidad de secuenciar ADN de organismos no cultivables.

En la metagenómica, ¿cuál es el objetivo principal de la secuenciación de amplicones?

Identificar y cuantificar la diversidad de microorganismos en una muestra.

Obtener genomas completos de microorganismos presentes en una comunidad.

Analizar la función metabólica de los genes microbianos en un entorno específico.

Secuenciar todo el ADN presente en una muestra sin amplificar genes específicos.

¿Cuál es el propósito principal de la normalización en un flujo de trabajo de secuenciación?

Ajustar las características de los datos

Eliminación de secuencias duplicadas

Parte de Frank

Authored by Mia Somocurcio

Biology

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MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

Si se quería identificar un microorganismo por su morfología, ¿qué método tradicional se usaba?

Gold standard

Microscopio óptico

Electroforesis capilar

Secuenciación Sanger

MULTIPLE SELECT QUESTION

45 sec • 1 pt

¿Cuáles son estudios metagenómicos?

Earth Microbiome Project

American gut project

Metahit

Human Microbiome Project

MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

Si se quiere realizar un estudio de taxonomía, ¿qué programa usarías y qué tipo de secuenciamiento aplicarías?

Kraken teniendo como input los datos generados por secuenciamiento por el enfoque shotgun metagenómico que contiene reads sin ensamblar.

QIIME2 con secuenciación por amplicones y datos trimados

MEGAN con secuenciación Illumina y ensamblaje metagenómico

BLAST con secuenciación Sanger y ensamblaje de novo

MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

¿Qué primers se usan para amplificar toda la región 16S?

1492R y 27F

515Y y 806R

8F y 1391R

338F y 806R

MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

Si se quiere analizar el género específico, ¿cuál sería el protocolo a seguir?

Amplificación de toda la región 16S (metataxonómica). Digestión por enzimas de restricción doble para hallar el genogrupo.

Amplificación de la región V4 del 16S (metagenómica). Ensamblaje de novo para identificar el género.

Amplificación de la región V4 del 18S (metataxonómica). Secuenciación por Sanger para el análisis de género.

Amplificación de toda la región 16S (metagenómica). Ensamblaje de novo para identificar el género.

MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

El ARNr ribosomal posee stems y loops, ¿cuáles regiones son variables y cuáles son permanentes?

Stems -> Conservadas; Loops -> Variables

Stems -> Variables; Loops -> Conservadas

Ambas son variables; Ambas son conservadas

Ambas son permanentes; Ambas son variables

MULTIPLE CHOICE QUESTION

30 sec • 1 pt

Diferencia entre metagenómica y metataxonómica

Metagenómica -> Analiza todo el genoma; Metataxonómica -> Amplifica solo 1 gen

Metagenómica -> Amplifica regiones específicas; Metataxonómica -> Analiza todo el genoma

Metagenómica -> Usa secuenciación Sanger; Metataxonómica -> Usa secuenciación Illumina

Metagenómica -> Identifica especies; Metataxonómica -> Identifica géneros

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